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基于CRISPR/Cas的分子檢測

也許一提到CRISPR/Cas技術,人們的第一反應是,CRISPR/Cas技術是一個高效的基因編輯系統。其實,CRISPR/Cas系統是一個多面手,不僅具有高效基因操作功能,還具有分子檢測能力。CRISPR/Cas是(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associate)成簇規律間隔短回文重復序列及相關蛋白質縮寫,它是微生物的天然“免疫系統”。

本文帶您了解一下CRISPR/Cas高效的分子檢測能力,CRISPR/Cas系統不但可以檢測核酸分子(DNA/RNA),還可以檢測非核酸分子(小分子化合物、重金屬、蛋白質、腫瘤循環細胞、外泌體等)。參與分子檢測常見的CRISPR/Cas系統有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。
01  核酸分子檢測

CRISPR/Cas系統在引導RNA(guide RNA,gRNA)的引導下識別目標核酸(DNA/RNA)序列后,激活Cas蛋白對靶向和非靶向核酸(DNA/RNA)分子切割。CRISPR/Cas系統在靶向識別和切割過程中轉化靶標核酸分子信號為檢測儀器或肉眼可觀察的信號。

依據檢測核酸分子類型,CRISPR/Cas技術核酸檢測可分為DNA(CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas12識別DNA序列)和RNA(CRISPR/Cas13識別RNA序列)檢測。不同的CRISPR/Cas系統識別的核酸類型不同,然而檢測過程中為了實現同一個CRISPR/Cas系統對DNA和RNA均能夠檢測,必須借助于轉錄技術(transcription,T)和逆轉錄(reverse transcription,RT)實現DNA與RNA的相互轉化。

根據檢測核酸分子時是否需要體外核酸擴增,CRISPR/Cas技術核酸檢測可分為輔助體外核酸擴增檢測和無體外核酸擴增檢測兩類。輔助體外核酸擴增檢測需先利用PCR、重組酶聚合酶等溫擴增(RPA)、環介導等溫擴增(LAMP)等技術,對靶向核酸序列進行體外擴增,隨后再通過CRISPR/Cas系統檢測靶標分子。與之不同,基于CRISPR/Cas的無體外核酸擴增檢測技術,能夠直接對靶標核酸進行檢測,具有操作步驟簡便、檢測耗時短、污染風險低等優點。

CRISPR/Cas核酸檢測系統能夠將靶向DNA分子信號高效轉化為熒光、化學、電化學等肉眼可見或可檢測的信號,以此實現對靶標核酸信號分子的精準檢測。在實際應用領域,該技術已廣泛用于多種病原體和基因特征檢測,包括寨卡、乙腦病毒、非洲豬瘟病毒、嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的核酸檢測,以及DNA甲基化分析、HPV16和18基因分型等。值得一提的是,基于CRISPR/Cas13開發的SARS-CoV-2核酸檢測系統,無需進行體外核酸擴增,檢測下限約為31拷貝/μl,僅需20分鐘即可完成檢測。此外,同樣基于CRISPR/Cas13構建的多通道熒光信號核酸分子檢測系統,一次能檢測169種人類相關病毒核酸,具備高通量、檢測迅速、成本低廉等顯著優勢 。

02  非核酸分子檢測

隨著對CRISPR/Cas分子檢測技術研究的逐步深入,檢測的靶標分子類型也逐漸豐富,可實現循環腫瘤細胞、小分子化合物、蛋白質分子、金屬離子、酶活性、抗生素、病原微生物等靶標檢測。檢測樣本類型從單一逐步走向復雜多樣,涵蓋人的血液、體液、牛奶、食品、環境樣本等。目前應用于非核酸分子檢測的CRISPR/Cas系統主要有Cas12a和Cas13a。CRISPR/Cas12a可以有效地檢測外泌體,此過程通過適配體技術與CRISPR/Cas12a技術聯合,轉化外泌體信號為儀器可檢測信號。伴隨著檢測系統的優化,檢測時間從120 ~20 min逐漸縮短,可實現POCT。CRISPR/Cas檢測的靶標分子從病原微生物到小分化合物,凸顯了CRISPR/Cas可檢測非核酸靶標分子的廣泛性、樣本類型的普遍性以及檢測操作的便捷性,非常適合海關、車站、學校等場所的POCT。

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