常規(guī)PCR，環(huán)介導(dǎo)的恒溫PCR（LAMP），重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）三種分子擴(kuò)增技術(shù)原理和對比
常規(guī)PCR
PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction）的縮寫，1983年出現(xiàn)的一種對已知DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。它利用耐高溫的DNA聚合酶（Taq 酶），將模板DNA，引物，脫氧核苷三磷酸（dNTP）和緩沖液等在不同溫度間循環(huán)，從而達(dá)到雙鏈DNA分離，引物粘合到模板上的互補(bǔ)區(qū)間，最后在DNA聚合酶作用下脫氧核苷三磷酸逐個(gè)添加到新合成的DNA鏈上的過程。通過PCR技術(shù)，特定DNA片段可以達(dá)到指數(shù)級別的擴(kuò)增，從原來的少量DNA分子擴(kuò)增到可以用儀器檢測的水平，利用這一特點(diǎn)可以對一些特異的病原或疾病標(biāo)志物進(jìn)行診斷。
近幾年，由于PCR技術(shù)的不斷成熟，特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的出現(xiàn)，使得基于qPCR的分子診斷產(chǎn)品日漸成為主流。但常規(guī)的PCR技術(shù)由于熱循環(huán)的需要，使這一技術(shù)完全依賴于電源和昂貴的PCR儀器，從而限制了這一技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室之外的應(yīng)用。由于這些缺點(diǎn)，科學(xué)界一直在試圖發(fā)展不需要使用PCR儀器的核酸擴(kuò)增方法，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展成為一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。
主要的步驟：
★DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
★引物與靶DNA退火 適當(dāng)降低溫度，使兩個(gè)引物分別結(jié)合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
★引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離后，又可作為模板與引物雜交，并且在DNA聚合酶的催化下，引導(dǎo)合成新的靶DNA鏈。如此反復(fù)進(jìn)行以上3個(gè)步驟，即可使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。
環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）
環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)表的一種核酸擴(kuò)增的方法，他利用特殊的引物設(shè)計(jì)方法和恒溫核酸鏈置換酶將少量目標(biāo)DNA在60分鐘內(nèi)擴(kuò)增到千百萬份。LAMP反應(yīng)中需要4-6個(gè)引物，這些引物特異性的識別模板DNA的6-8個(gè)DNA區(qū)間。在每一套LAMP的引物中，包括兩個(gè)外部引物（F3和B3），兩個(gè)內(nèi)部引物（FIP和BIP）以及兩個(gè)環(huán)導(dǎo)引物（loop F和loop B）。LAMP引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)原理如圖1所示。
LAMP的反應(yīng)混合物由dNTPs，鏈置換聚合酶，熒光染料，引物和DNA模板組成。用于LAMP反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)，其特征在于使用四種不同的引物，這些引物是專門設(shè)計(jì)用于識別靶DNA的六個(gè)不同區(qū)域的。前內(nèi)引物（FIP）由3' 末端的F2區(qū)和5' 末端的F1c區(qū)組成；正向外引物（F3引物）由F3區(qū)組成，其與模板序列的F3c區(qū)互補(bǔ)；向后內(nèi)部引物（BIP）由3' 末端的B2區(qū)域和5' 末端的B1c區(qū)域組成。向后外引物（B3引物）由B3區(qū)組成，其與模板序列的B3c區(qū)互補(bǔ)。當(dāng)FIP的F2區(qū)與靶DNA的F2c區(qū)雜交并啟動互補(bǔ)鏈合成時(shí)，擴(kuò)增開始，然后F3引物與靶DNA的F3c區(qū)域雜交并延伸，取代FIP連接的互補(bǔ)鏈。該置換鏈在5' 末端形成環(huán)，這種在5' 末端具有環(huán)的單鏈DNA然后用作BIP的模板，B2與模板DNA的B2c區(qū)域雜交，啟動DNA合成，導(dǎo)致形成互補(bǔ)鏈并打開5' -末端環(huán)，隨后，B3與靶DNA的B3c區(qū)域雜交并延伸，置換BIP連接的互補(bǔ)鏈，這導(dǎo)致形成啞鈴形DNA。通過Bst DNA聚合酶將核苷酸添加到F1的3' 末端，其在5' 末端延伸并打開環(huán)，啞鈴形DNA現(xiàn)在轉(zhuǎn)變?yōu)榍o環(huán)結(jié)構(gòu)（參見a和b）。該結(jié)構(gòu)用作LAMP循環(huán)的引發(fā)劑，其是LAMP反應(yīng)的第二階段。也可以添加環(huán)引物用于LAMP的指數(shù)擴(kuò)增，獲得的最終產(chǎn)品是具有不同莖長度的莖環(huán)DNA和具有多個(gè)環(huán)的各種類似于菜花的結(jié)構(gòu)的混合物。
重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）
重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃左右。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件（見圖2）。整個(gè)過程進(jìn)行得非?？欤话憧稍谑昼娭畠?nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物 （Piepenburg等，2006）。
RPA不但可以快速擴(kuò)增，還支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計(jì)，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量（nmol）最好不要超標(biāo)太多。如果在一個(gè)反應(yīng)中使用兩個(gè)以上的擴(kuò)增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，檢測多個(gè)擴(kuò)增事件的探針、設(shè)備以及熒光物質(zhì)的兼容性都需要提前考慮。RPA還可以對模板進(jìn)行定量。因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到可檢出水平的時(shí)間，是依賴于反應(yīng)起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增產(chǎn)物就越快達(dá)到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實(shí)驗(yàn)安排，確保對照反應(yīng)是同時(shí)開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因?yàn)殒V離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會開始。此外，較慢的擴(kuò)增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計(jì)來減慢RPA的反應(yīng)速度。目前大多數(shù)RPA相關(guān)產(chǎn)品還是由英國的Twist Dx開發(fā)的。
重組酶/引物復(fù)合物尋找模板DNA的同源序列（紅色/藍(lán)色）。鏈交換后，置換的鏈由gp32（綠色）結(jié)合，引物通過Bst聚合酶（藍(lán)色）延伸。兩個(gè)引物結(jié)合/延伸最終產(chǎn)生一個(gè)完整的擴(kuò)增拷貝。重復(fù)該過程導(dǎo)DNA指數(shù)擴(kuò)增。（Piepenburg等，2006）
