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根據(jù)Cas蛋白的組成不同，CRISPR/Cads系統(tǒng)分為兩大類(lèi)，即ClassⅠ和ClassⅡ。其中ClassⅠ系統(tǒng)的效應(yīng)復(fù)合物由多個(gè)Cas蛋白亞基組成，該類(lèi)別的共同特征是利用多個(gè)Cas蛋白效應(yīng)復(fù)合物實(shí)現(xiàn)功能；而ClassⅡ系統(tǒng)的效應(yīng)復(fù)合物則是單個(gè)多結(jié)構(gòu)域蛋白，如Cas9、Cas12、Cas13等。由于單個(gè)效應(yīng)蛋白便于操作，因此ClassⅡ類(lèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中更為廣泛。

1、Cas酶的選擇

Cas酶在CRISPR檢測(cè)中扮演著至關(guān)重要的角色，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并切割與目標(biāo)序列互補(bǔ)的DNA或RNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的高效檢測(cè)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹袠?biāo)基因、操作條件等差異，選擇合適Cas酶也尤為重要。

Cas12a：又稱(chēng)Cpf1，它是一種核酸內(nèi)切酶，能特異性識(shí)別并剪切帶PAM（5'-TTTN-3'或5'-TTN-3'）的雙鏈DNA（dsDNA）靶標(biāo)，使DNA雙鏈斷裂并生成黏性末端。此外，對(duì)單鏈DNA（ssDNA）靶標(biāo)的識(shí)別和剪切不依賴(lài)PAM序列。

Cas12b:同樣是一種依賴(lài)SgRNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，能特異性識(shí)別并剪切帶PAM(5'-TTN-3)的dsDNA，使DNA雙鏈斷裂并生成黏性末端。特別的是，它在45-65°C的中高溫環(huán)境中具備更高的切割活性。

Cas13a:它在SgRNA引導(dǎo)下，可以識(shí)別并切割體系中的特異單鏈RNA。在切割特定RNA序列后，其“附屬切割”活性會(huì)被激活，可高效地切割體系中的任意序列sSRNA。

Cas13a:它在sgRNA引導(dǎo)下，可以識(shí)別并切割體系中的特異單鏈RNA。在切割特定RNA序列后，其“附屬切割”活性會(huì)被激活，可高效地切割體系中的任意序列sSRNA。

2、crRNA設(shè)計(jì)與合成

crRNA是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，它識(shí)別并引導(dǎo)Cas蛋白到目標(biāo)核酸序列位置，通過(guò)與目標(biāo)DNA或RNA序列的互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)Cas蛋白進(jìn)行精確的切割或編輯。crRNA極大影響檢測(cè)體系的靈敏度，因此在實(shí)驗(yàn)中我們需選擇效果最優(yōu)的crRNA。

crRNA設(shè)計(jì)合成涉及以下注意事項(xiàng)：

1.目標(biāo)序列選擇:選擇一個(gè)特定的目標(biāo)序列作為設(shè)計(jì)的起點(diǎn)，通常是根據(jù)目標(biāo)基因的功能和相關(guān)研究的需要來(lái)確定，選擇基因組中的高拷貝重復(fù)片段作為靶標(biāo)基因，

2.PAM序列選擇:在目標(biāo)序列附近選擇適當(dāng)?shù)腜AM序列。

3.避免剪切位點(diǎn):避免剪切位點(diǎn)與其他非目標(biāo)基因席列相匹配。這可以通過(guò)使用序列比對(duì)軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)，

4.避免剪切位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu):避免目標(biāo)序列和其他非目標(biāo)序列形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5.序列選擇與驗(yàn)證:在設(shè)計(jì)過(guò)程中，可以使用序列比對(duì)工具和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具來(lái)評(píng)估設(shè)計(jì)的crRNA的特異性和有效性，最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)設(shè)計(jì)的crRNA的特異性和剪切效果。

以下是我們常用的crRNA引物設(shè)計(jì)序列:

1.LbCas12a:

5'AAUUUCUACUAAGUGUAGAUNNNNNNNN 3’(N表示與特導(dǎo)靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的spacer區(qū))

2.Aapcas12b:

5'GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNN3'，(N表示與特導(dǎo)靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的spacerx)

3.LwaCas13a:

5'GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUNNNNNN3'，(N表示與AAAACNNNN特異靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的spacer區(qū)，建議spacer區(qū)長(zhǎng)度為20-28nt)

4.LbuCas13a：

5'GGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACCAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'，(N表示與特異靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的spacer區(qū))

3、恒溫?cái)U(kuò)展體系選擇

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Isothermal Amplification）是實(shí)現(xiàn)快速、精確檢測(cè)的關(guān)鍵方法之一。它相比傳統(tǒng)的PCR方法更加簡(jiǎn)便和快速，特別是在需要現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)或設(shè)備條件有限的情況下顯示出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。下面為大家介紹一下常見(jiàn)的恒溫?cái)U(kuò)增體系。

1. LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）

特點(diǎn): LAMP技術(shù)依賴(lài)于一組特制的引物和Bst DNA聚合酶的特異性裂解活性，能在一個(gè)恒定的溫度（通常是60°C-65°C）下進(jìn)行。這個(gè)方法能在短時(shí)間內(nèi)（一般小于一個(gè)小時(shí)）高效地進(jìn)行擴(kuò)增，并且可以通過(guò)肉眼觀察擴(kuò)增結(jié)果（如加入熒光劑）。

2. RPA（重組酶聚合酶擴(kuò)增）

特點(diǎn): RPA技術(shù)在室溫或接近室溫條件（37°C-42°C）下工作，無(wú)需特殊設(shè)備。RPA通過(guò)使用重組酶來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA，在較短時(shí)間內(nèi)完成目標(biāo)DNA的擴(kuò)增。3.NASBA（核酸序列依賴(lài)的擴(kuò)增） 特點(diǎn)：NASBA反應(yīng)在恒溫條件（41°C-42°C）下進(jìn)行，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以是單鏈DNA或雙鏈RNA。可以檢測(cè)到較低濃度的RNA靶標(biāo)，但對(duì)試劑的穩(wěn)定性要求較高，且操作相對(duì)復(fù)雜。

3.NASBA（核酸序列依賴(lài)的擴(kuò)增）

特點(diǎn)：NASBA反應(yīng)在恒溫條件（41°C-42°C）下進(jìn)行，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以是單鏈DNA或雙鏈RNA?？梢詸z測(cè)到較低濃度的RNA靶標(biāo)，但對(duì)試劑的穩(wěn)定性要求較高，且操作相對(duì)復(fù)雜。

在選擇恒溫?cái)U(kuò)增體系時(shí)，需要綜合考慮多種因素，包括：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、目?biāo)序列特性、實(shí)驗(yàn)條件、以及擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性和效率等。以下是在選擇恒溫?cái)U(kuò)增體系時(shí)考慮的兩大重要因素：

1)目標(biāo)序列特性:目標(biāo)序列的長(zhǎng)度、GC含量、是否存在二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素都會(huì)影響到恒溫?cái)U(kuò)增的效果。因此在選擇恒溫?cái)U(kuò)增體系時(shí)，需要充分了解目標(biāo)序列的特性，并選擇適合該特性的擴(kuò)增體系，

2)擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性和效率:恒溫?cái)U(kuò)增體系的穩(wěn)定性和效率是選擇時(shí)需要考慮的重要因素。穩(wěn)定的體系可以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性;高效的體系可以縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率.

RISPR/Cas未來(lái)方向

第一，是新的Cas蛋白的開(kāi)發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來(lái)發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測(cè)通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。

第二，是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺(tái)結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管，以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上，從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號(hào)擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號(hào)輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開(kāi)發(fā)出的CARMAN技術(shù)，可以對(duì)數(shù)十個(gè)樣本，上百種病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，為解決通量低的問(wèn)題提供了方法等。

RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列