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2022年5月起，猴痘疫情在世界范圍內(nèi)迅速傳播，截至2023年10月6日，已有115個國家向世衛(wèi)組織報告了9萬余例確診病例和157例死亡病例。2023年6月以來，我國多個省份先后報告1000余例猴痘確診病例，引發(fā)新增本土續(xù)發(fā)疫情和隱匿傳播的較高風險。
        猴痘是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患病，與天花病毒（VARV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VACV）同屬痘病毒科正痘病毒屬。自20世紀80年代在世界范圍內(nèi)根除天花后，MPXV成為人類最關注的正痘病毒。由于正痘病毒屬表面蛋白具有較高的同源性（>90%），以VACV或改良牛痘病毒為基礎的天花疫苗產(chǎn)生的中和抗體可以持續(xù)數(shù)十年，對猴痘提供約85%的交叉保護作用。
       然而，自從世衛(wèi)組織1980年宣布消滅天花后，大多數(shù)國家終止了常規(guī)的天花疫苗接種，導致全球范圍內(nèi)相當一部分人群對猴痘病毒缺乏免疫力。此外，在接種天花疫苗的人群中，其保護作用也會隨著時間的推移而緩慢衰減，從而增加了感染猴痘病毒的風險。
      鑒于國內(nèi)的猴痘疫情和快速增加的猴痘病例，需要在發(fā)病早期快速甄別出陽性病例，并指導后續(xù)的防治策略和疫情防控。猴痘病毒的檢測可通過病毒培養(yǎng)和分離鑒定、電子顯微鏡、聚合酶鏈反應（PCR）、免疫熒光檢測等技術方法進行。猴痘病毒培養(yǎng)和分離鑒定為確證試驗，但猴痘的培養(yǎng)只能在生物安全III級實驗室由受過相關安全程序培訓的具有相應準入資質(zhì)、并具有豐富病毒分離培養(yǎng)經(jīng)驗的人員進行，但病毒分離陽性率低，需耗時數(shù)天。不建議將病毒分離作為常規(guī)檢測和診斷程序。電子顯微鏡可用于評估樣本中潛在的猴痘病毒。但電子顯微鏡需要專門的專業(yè)技術人員，技術要求較高，且對樣本中病毒顆粒的濃度要求較高。
因此，由于所需的高技術技能和設施，這種方法并不常規(guī)用于猴痘病毒的檢測。其他檢測方法，如血清中和試驗、凝膠沉淀、免疫熒光試驗等，雖然也具有一定的診斷價值，但操作復雜，耗時長，不適合作為猴痘病毒的常規(guī)實驗室檢測。
      目前，聚合酶鏈反應（PCR）檢測是首選的猴痘檢測方法，其中實時PCR（qPCR）技術是猴痘病毒檢測和分型最有效的方法。該方法的優(yōu)點是靈敏度高、通量大。但目前針對猴痘的PCR檢測試劑存在檢測時間長、穩(wěn)定性差、操作繁瑣、與其它正痘病毒存在交叉反應的風險等缺陷。而且，猴痘病毒感染潛伏期較長，實時熒光定量PCR分子診斷方法對樣品采集、實驗操作人員及配套檢測設備有較高要求，無法保證快速鑒別感染者。目前沒有可以廣泛使用的商業(yè) PCR檢測試劑盒。因此，針對猴痘病毒有效的快速、靈敏、精準的檢測方法亟需建立。
      2023年10月16日，中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所郭斐課題組在 Cell Reports Methods 期刊發(fā)表了題為：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究論文。
該研究建立了一種快速精準的猴痘病毒檢測方法，通過將等溫擴增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測體系聯(lián)合，可以實現(xiàn)猴痘病毒DNA在30分鐘內(nèi)的快速檢測，檢測靈敏度1個拷貝數(shù)，同時能夠精準區(qū)分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的實用價值。

研究團隊首先設計了兩個crRNA的檢測體系池，其中一組靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守區(qū)D6R和E9L，可以檢測所有的正痘病毒；另外一組靶向猴痘病毒特有的區(qū)域N3R和N4R。通過對crRNA的設計和篩選，建立了基于CRISPR/Cas12a的熒光報告體系（圖1）。

圖1：CRISPR-Cas12a檢測體系的建立及crRNA的篩選
進一步針對選擇的crRNA，分別檢測不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒模板以及病毒DNA模板，觀察到CRISPR-Cas12a單獨檢測體系的檢測限約為108拷貝數(shù)，不同crRNA的聯(lián)合可以將檢測限提高到107拷貝數(shù)，同時實現(xiàn)了正痘病毒與猴痘病毒的區(qū)分。并且為了實現(xiàn)最低檢測限，研究團隊團隊將等溫擴增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測體系聯(lián)合，最終能夠達到1個拷貝的最低檢測限，大大提高了檢測體系的靈敏度（圖2）。

圖2：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測體系的實現(xiàn)1個拷貝的最低檢測限
為了驗證檢測體系實際應用的可靠性與準確性，針對中國大陸第一例猴痘病例的拭子樣本進行了檢測。該體系同樣實現(xiàn)了1個拷貝數(shù)的最低檢測限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中檢測到了猴痘病毒的DNA，證實了體系應用的可靠性。同時針對猴痘病毒核酸檢測試劑國家參考品的檢測，陰性參考品中未檢測到猴痘病毒的DNA，進一步證實了檢測體系的準確性（圖3）。

圖3：RPA聯(lián)合CRISPR/Cas12a檢測體系對臨床樣本的檢測
最終為了提高檢測效率，進一步優(yōu)化反應體系到單管中，大大的縮短了檢測時間以及操作步驟。在提取得到待測DNA后，15分鐘到30分鐘內(nèi)即可實現(xiàn)樣本的快速檢測，且靈敏度高達1個拷貝數(shù)。相比于傳統(tǒng)熒光PCR的2小時，大大縮短了檢測時間，提高了檢測的靈敏度（圖4）。

圖4：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測體系的優(yōu)化
綜上所述，該研究建立了猴痘病毒的快速精準的檢測方法，通過crRNA的篩選建立了一套CRISPR檢測體系，并聯(lián)合等溫擴增實現(xiàn)了猴痘病毒的快速、靈敏的精準檢測。為猴痘病毒的快速診斷提供了有力的技術支持。
中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所助理研究員趙斐、博士生胡亞美、范張玲，中國疾病預防控制中心黃保英為論文共同第一作者。中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所郭斐研究員、中國疾病預防控制中心譚文杰研究員和中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所許豐雯副研究員為論文共同通訊作者，感謝合作者加拿大麥吉爾大學梁臣教授、北京同仁醫(yī)院房居高教授、北京醫(yī)院艾斌教授的大力支持。該研究獲得了中國醫(yī)學科學院醫(yī)學科技創(chuàng)新工程、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金等項目的資助。
論文鏈接：

https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00284-9

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