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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

LbCas12a (又名 Cpf1)核酸酶來(lái)源于 Lachnospiraceae bacterium ND2006 菌株。LbCas12a 是由 crRNA 介導(dǎo)的 DNA 核酸內(nèi)切酶，在靶標(biāo)雙鏈 DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 LbCas12a 特異地剪切單鏈 DNA 靶標(biāo)不依賴(lài) PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 LbCas12a 的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當(dāng) LbCas12a酶與 crRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會(huì)被激活針對(duì)非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。因此，LbCas12a 酶不僅可用于體外 dsDNA 的特異剪切，也可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)，詳見(jiàn)本公司開(kāi)發(fā)的 HOLMES[1]核酸快檢技術(shù)。

產(chǎn)品組分

a. LbCas12a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；

b. Control Target DNA and crRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個(gè)月內(nèi)使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系。

保存條件

Control Target DNA and crRNA 于-80℃儲(chǔ)存，其余組分-20℃儲(chǔ)存；≤ 0℃運(yùn)輸。

活性定義

在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmol

ssDNA 探針?biāo)璧?Cas12a 酶量定義為 1 transU[2]。

例：若某批次 LbCas12a 酶的反式切割活性為 50.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LbCas12a 酶可在 1 min 內(nèi)，在上述指定的反應(yīng)條件下，反式切割 50 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU 數(shù)值詳見(jiàn)各批號(hào)的 COA 檢測(cè)報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)流程

1、順式剪切實(shí)驗(yàn)

c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。

l若用核酸電泳來(lái)分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因?yàn)?ssDNA靶標(biāo)會(huì)被反式激活的 Cas12a 進(jìn)一步切碎。對(duì)于 20 μL 順式剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長(zhǎng)度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長(zhǎng)度 target DNA需要的 Cas 酶和 crRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計(jì)算，建議保持 Cas 酶:crRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切完全。

37℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。

2. 反式剪切實(shí)驗(yàn)

d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。

*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，LbCas12a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋?zhuān)♂尯笮枇⒓词褂茫ㄈ粢♂尯蟮?Cas12 酶長(zhǎng)期保存，請(qǐng)使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋?zhuān)珮O低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實(shí)驗(yàn)）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間可參考各批號(hào)Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見(jiàn)本公司提供的 COA檢測(cè)報(bào)告！

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)熒光信號(hào)，37℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注意事項(xiàng)

1. 不同來(lái)源的 Cas12a 酶，其識(shí)別靶標(biāo)所需的 PAM 位點(diǎn)也略有不同，其中大部分 Cas12a 酶可識(shí)別 TTN位點(diǎn)，而部分 Cas12a 則識(shí)別 TTTN 位點(diǎn)。

2. Cas12a 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a 在 crRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo)需帶有 PAM 位點(diǎn)，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴(lài) PAM 位點(diǎn)。

3. Cas12a 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時(shí)，Cas12a/crRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)體系中任意序列的單鏈 DNA切碎。

4. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗(yàn)，可參考本公司的 HOLMES 體系[1]。

5. 驗(yàn)為防止 RNase 污染，請(qǐng)保持實(shí)驗(yàn)區(qū)干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗(yàn)所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

6. Cas12a 酶對(duì)熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。

7. 如無(wú)特殊說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)的剪切反應(yīng)體系適用于本公司提供的所有類(lèi)型的 Cas12a 酶。

8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。

參考文獻(xiàn)

[1] Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20.

[2] [2] Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a Trans-Cleavage Units to Facilitate CRISPR Diagnostics[J]. Frontiers in Microbiology. 2021, 12: 766464.