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阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種細胞增殖檢測試劑，對各種人和哺乳動物細胞、細菌和真菌提供一種快速和敏感的細胞增殖和毒性檢測方法。

阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種基于刃天青（resazurin）的檢測試劑。刃天青作為一種一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據細胞代謝還原情況發(fā)生顏色變化。氧化態(tài)的刃天青呈紫藍色且基本無熒光，其還原態(tài)產物試鹵靈（resorufin）轉變?yōu)榉奂t色且高度熒光，產生的熒光強度與呼吸活細胞數量呈正比。通過檢測呼吸過程中氧化水平，阿爾瑪藍用作一種定量檢測細胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍的顏色變化可通過普通分光光度計檢測吸光度變化，檢測波長為570nm，參考波長為600nm；阿爾瑪藍的熒光變化可通過熒光光度計檢測，激發(fā)波長在530~560nm之間，發(fā)射波長為590nm。

檢測原理：（細胞增殖實驗 Cell proliferation assay））

1.生長中細胞引起Alamar Blue的化學還原反應；

2. 持續(xù)性細胞生長維持還原環(huán)境，使得Alamar Blue呈紅色，發(fā)強熒光；

3. 生長受抑制維持氧化環(huán)境，使得Alamar Blue呈藍色，無熒光；

4. 使用基于熒光或吸光值檢測的儀器收集數據；

5. 熒光檢測的激發(fā)波長為530~560nm之間，發(fā)射波長為590nm；

6. 吸光值檢測的波長為570nm，參考波長為600nm；

保存方法：

室溫12個月穩(wěn)定，2-8°C保存20個月穩(wěn)定；避光保存；

產品優(yōu)勢：

簡單：水溶性，只需添加和測量即可；

靈活：顯色和熒光檢測，懸浮細胞和貼壁細胞；

無毒：對細胞無毒，對使用者和環(huán)境也無毒；

可靠：大量引用用于細胞毒性和活力檢測；

規(guī)模化：簡單放大體系用于高通量分析

高靈敏：最低可檢測到50個細胞

穩(wěn)定高：獨特緩沖配方使其能用于長期研究；

經濟：不需要細胞裂解，使細胞能繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)分析；操作時請注意避光。

注意事項

1. 還原態(tài)的Alamar Blue在水或水溶性緩沖液如PBS中很不穩(wěn)定，但在培養(yǎng)基內非常穩(wěn)定。為了確定特定實驗還原態(tài)Alamar Blue的吸光度/熒光值，需準備100%還原態(tài)Alamar Blue試劑：將Alamar Blue與細胞培養(yǎng)基按照1:10的比例混合，高壓滅菌15min即可。

2. 適宜的細胞密度能夠增加檢測靈敏度。對于96孔板，建議每孔接種100μl細胞，細胞濃度范圍：貼壁細胞為100-10,000個/孔，懸浮細胞在2,000-50,000個/孔，以培養(yǎng)基為空白對照。對于384孔板，細胞濃度和接種量均減半。

3. 影響細胞對Alamar Blue反應的兩大變量為孵育時間和鋪板密度，建議實驗前需先摸索優(yōu)化這兩個因素。細胞密度過高或孵育時間過長都會導致繼發(fā)性還原反應，紅色產物停止增加并開始衰減，導致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4. 微生物污染會還原Alamar Blue。因此對被污染細胞使用Alamar Blue檢測會引起錯誤結果。

5. Alamar Blue可以用分光光度計或熒光計檢測，但熒光靈敏度高，實驗誤差小，推薦熒光檢測。

6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明

一、制作標準曲線（測定最佳孵育時間和細胞數量）

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數生長期細胞），對細胞計數。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。注：設置陰性對照：細胞培養(yǎng)基中不加入細胞；陽性對照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)（37℃,5% CO2）一定時間。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm。

5. 普通分光光度計在570 nm測定吸光度，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標準曲線。以細胞數量或孵育時間為橫坐標（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標（Y軸）。根據此標準曲線可以測定出適合的細胞數量或孵育時間（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致）。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數生長期細胞），對細胞計數。建議細胞數量為104/mL，具體每孔需要的細胞數量，需根據細胞類型決定。

2. 細胞中加入待檢測藥物，為檢測藥物對細胞增殖的作用，請設置合適的對照組，包括刺激細胞和非刺激細胞。

3. 混勻，放入細胞培養(yǎng)箱內孵育（37℃,5% CO2）一段時間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

5. 放入細胞培養(yǎng)箱內孵育（37℃,5% CO2）4-8 h，最佳孵育時間取決于細胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm。

7. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力計算                               

1.普通分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570 nm波長的消光系數=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600 nm波長的消光系數=117216；

A570=檢測孔在570 nm波長的吸亮度；

A600=檢測孔在600 nm波長的吸亮度；

E570′=還原型Alamar Blue在570 nm波長的消光系數=155677；

E600′=還原型Alamar Blue在600 nm波長的消光系數=14652；

C570=陰性對照孔在570 nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無細胞）；

C600=陰性對照孔在600 nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無細胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作為替代，則：

E540=氧化型Alamar Blue在540 nm波長的消光系數=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630 nm波長的消光系數=34798；

E540′=還原型Alamar Blue在540 nm波長的消光系數=104395；

E630′=還原型Alamar Blue在630 nm波長的消光系數=5494；

2.熒光分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）= （實驗組F590-陰性對照組F590）/（100%還原型陽性對照F590-陰性對照組F590）×100

F590=590 nm波長熒光值

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